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1. 凋亡時(shí)間處理過長(zhǎng),使細(xì)胞全部死亡。建議重新摸索細(xì)胞凋亡條件,使細(xì)胞處于不同的凋亡狀態(tài)。2. 對(duì)于貼壁細(xì)胞,胰蛋白酶消化時(shí)間過長(zhǎng)或機(jī)械刮擦細(xì)胞會(huì)暫時(shí)破壞質(zhì)膜,使Annexin V能夠與細(xì)胞膜胞內(nèi)面上的磷脂酰絲氨酸結(jié)合,導(dǎo)致假陽(yáng)性染色。建議在胰蛋白酶消化或機(jī)械刮擦細(xì)胞后,讓細(xì)胞在最佳細(xì)胞培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基中培養(yǎng)約30分鐘,以恢復(fù)其膜完整性。◆實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用什么儀器觀察?實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以通過流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡進(jìn)行觀察,但更推薦使用流式細(xì)胞儀。因?yàn)檎5募?xì)胞和凋亡的細(xì)胞膜上都有磷脂酰絲氨酸(PS),只是凋亡細(xì)胞膜外更多,可以結(jié)合更多的Annexin V,流式細(xì)胞儀更靈敏,可以區(qū)分出微小差異,將正常細(xì)胞與凋亡細(xì)胞分成不同的兩群,但如果用熒光顯微鏡,可能觀察不到這一差別,尤其是貼壁細(xì)胞。若要在成像測(cè)定中檢測(cè)細(xì)胞凋亡,推薦使用SuperView? 488 Caspase-3 Assay Kit for Live Cells。◆流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡,結(jié)果圖中的各個(gè)象限代表什么狀態(tài)的細(xì)胞?左上角:Annexin V-/PI+,機(jī)械損傷細(xì)胞;右上角: AnnexinV+/PI+,晚期凋亡細(xì)胞或壞死;右下角:AnnexinV+/PI-,早期凋亡細(xì)胞;左下角:AnnexinV-/PI-,正常細(xì)胞。◆這款試劑盒可同時(shí)檢測(cè)出凋亡率和細(xì)胞周期分布嗎?不可以。檢測(cè)細(xì)胞凋亡時(shí)PI結(jié)合的是核酸,包括DNA和RNA。而PI用于檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí)需要只結(jié)合DNA,由于RNA的干擾,用細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒測(cè)出來的細(xì)胞周期不準(zhǔn)。同時(shí),凋亡檢測(cè)與周期檢測(cè)時(shí)PI的工作濃度以及樣本處理都不一樣。 如果需要進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè),推薦Cell Cycle and Apoptosis Kit(C6031)◆各象限代表的細(xì)胞狀態(tài)問題?Q1:(AnnexinV-染料)-/PI+,此區(qū)域的細(xì)胞為壞死細(xì)胞。也可能有少數(shù)的晚期凋亡細(xì)胞在其中,甚至機(jī)械損傷的細(xì)胞也包含其中。Annexin V-/PI+越多,實(shí)驗(yàn)結(jié)果越不可信,建議實(shí)驗(yàn)中盡量控制這一象限細(xì)胞比例。Q2: (AnnexinV+染料)+/PI+,此區(qū)域的細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞或壞死。Q3:(AnnexinV-染料)+/PI-,此區(qū)域的細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞。Q4:(AnnexinV-染料)-/PI-,此區(qū)域的細(xì)胞為活細(xì)胞。
◆假陽(yáng)性問題?
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