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產品內容
儲存條件本產品應置于-20℃儲存，組分B需避光，避免反復凍融。有效期見外包裝。注：組分A和B使用時請佩戴口罩、手套，接觸皮膚，請立即用大量水沖洗。產品介紹細胞凋亡的一個顯著特點是細胞染色體DNA的降解，這種降解非常特異并有規(guī)律，所產生的不同長度的DNA片段為180 bp-200 bp的整數(shù)倍，表現(xiàn)為瓊脂糖凝膠電泳中呈現(xiàn)特異的梯狀Ladder圖譜。本試劑盒采用TUNEL法，應用末端脫氧核糖核苷酸轉移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）在凋亡細胞中斷裂DNA的3′-OH末端催化摻入YF?/Cy-dUTP，YF?/Cy-dUTP標記的DNA可以用熒光顯微鏡直接觀察或者用流式細胞儀定量。TUNEL法可以選擇性的檢測凋亡細胞，而非壞死細胞或因輻照和藥物治療而造成的DNA鏈斷裂的細胞。標記的dUTP（如地高辛-dUTP、生物素-dUTP），可以直接進行原位檢測，是一種更快速、直接的檢測手段。注意事項1. 熒光染料均存在淬滅問題，保存和使用過程中請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。2. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
UE-T6067S/T6067L1. 有些細胞或組織，比如平滑肌核酸酶或聚合酶活性水平較高，使得DNA全部被切斷，易導致假陽性。建議：取出細胞或組織后要立即固定并充分固定，以阻止這些酶的活性，同時設置陰性對照。2. 內源性過氧化物酶影響，建議：對于肝臟、腎臟等血細胞含量多的組織，適當延長封閉時間和升高過氧化氫的濃度。3. 固定液濃度過高或過低，導致組織中心部分固定效果不佳，而使得中心部細胞自溶、DNA鏈出現(xiàn)不規(guī)則斷裂，產生假陽性。建議：推薦使用4%多聚甲醛。4. TdT 酶反應時間過長或Tunel反應過程中反應液發(fā)生蒸發(fā)或滲漏，細胞或組織表面不能保持濕潤。注意控制反應時間，并確保TdT 酶反應液能很好地覆蓋樣品。5. 石蠟、脂肪、血液、體液等都較易與染料結合，所以組織切片制作時要保持干凈、脫蠟要徹底。6. 有些試劑或細胞存在自發(fā)熒光，選擇染料時要避開自發(fā)熒光的顏色。◆為什么沒有染上熒光？1. 固定不充分。固定液首選4%多聚甲醛，現(xiàn)用現(xiàn)配。不建議使用乙醇，乙醇固定液對組織的滲透力較弱，影響TUNEL標記效率.2. 細胞膜和核膜的通透不充分，TdT酶未能到達核內。細胞與冰凍切片，可用0.2% Triton X-100溶液通透5-30min，石蠟切片推薦使用蛋白酶K，37℃通透30 min；不同的細胞和組織所需要的通透時間略有不同，時間太長容易脫片，適當調整。3. 延長標記時間至2h，并適當增加TdT酶及dUTP的用量。4. 確定實驗對象細胞有凋亡。準備一份DNase I處理的陽性對照，驗證TdT酶反應是否正確進行。◆如何對細胞核進行復染？可在TUNEL反應結束后對細胞核進行染色。◆為什么熒光背景高？1. 支原體污染：可以使用支原體染色檢測試劑盒驗證。2. TdT 酶反應時間過長，可以用試劑盒提供的TdT酶稀釋液將TdT酶稀釋2-5倍后再按照說明書操作，稀釋后的TdT酶僅供當日使用。3. 處于高速分裂和增殖狀態(tài)中的細胞，有時也會出現(xiàn)細胞核中的DNA 斷裂。建議：在非高增殖期取樣檢測；4. 有些試劑或細胞存在自發(fā)熒光，選擇染料時要避開自發(fā)熒光的顏色。5. DAB 孵育時間過長，減少DAB 染色時間。6. Biotin-X-dUTP 的非特異性結合，在TdT 酶反應之后，再用含0.1% Triton X-100 和1 mg/ml BSA 的PBS 洗三次。◆標記率低？1. 乙醇、甲醇或甲醛（市面上購買的甲醛大多含有甲醇）固定的樣品標記效率較低（因為在固定時染色質未能與蛋白質交聯(lián)，而在操作中丟失），采用推薦的固定液。2. 固定時間過長，導致交聯(lián)程度過高，減少固定時間。3. 貼壁細胞如果使用藥物誘導凋亡，會細胞皺縮，貼壁黏附力降低，導致凋亡細胞容易脫落。建議：在凋亡誘導結束后，可以對多孔板進行1000g離心5min，然后再吸出培養(yǎng)基并用PBS洗滌。如果沒有適合的離心機，請注意操作輕緩，防止發(fā)生凋亡的細胞在洗滌時被洗去。后續(xù)整個操作也需要輕緩。◆在蛋白酶K中消化組織樣品多久？大部分組織樣品需要充分消化15分鐘。最佳的培養(yǎng)時間根據(jù)組織類型和厚度而不同。腦組織比其他組織需要更長的蛋白酶處理時間。◆實驗的組織切片應該多厚？老鼠腸、腎臟、肝臟、心臟和結腸厚度5–20 μm。
參考文獻1.Apoptosis caused by Hsp90 inhibitor geldanamycin in Leishmania donovani during promastigote-to-amastigote transformation stage應用方向：細胞凋亡染色&流式分析
2.Notch gain of function in mouse periocular mesenchyme downregulates FoxL2 and impairs eyelid levator muscle formation, leading to congenital blepharophimosis應用方向：切片染色
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