螞蟻淘/YF^?488 TUNEL 細胞凋亡試劑盒（綠色熒光）/20T/T6013S

1. 有些細胞或組織，比如平滑肌核酸酶或聚合酶活性水平較高，使得DNA全部被切斷，易導(dǎo)致假陽性。建議：取出細胞或組織后要立即固定并充分固定，以阻止這些酶的活性，同時設(shè)置陰性對照。2. 內(nèi)源性過氧化物酶影響，建議：對于肝臟、腎臟等血細胞含量多的組織，適當(dāng)延長封閉時間和升高過氧化氫的濃度。3. 固定液濃度過高或過低，導(dǎo)致組織中心部分固定效果不佳，而使得中心部細胞自溶、DNA鏈出現(xiàn)不規(guī)則斷裂，產(chǎn)生假陽性。建議：推薦使用4%多聚甲醛。4. TdT 酶反應(yīng)時間過長或Tunel反應(yīng)過程中反應(yīng)液發(fā)生蒸發(fā)或滲漏，細胞或組織表面不能保持濕潤。注意控制反應(yīng)時間，并確保TdT 酶反應(yīng)液能很好地覆蓋樣品。5. 石蠟、脂肪、血液、體液等都較易與染料結(jié)合，所以組織切片制作時要保持干凈、脫蠟要徹底。6. 有些試劑或細胞存在自發(fā)熒光，選擇染料時要避開自發(fā)熒光的顏色。◆為什么沒有染上熒光？1. 固定不充分。固定液首選4%多聚甲醛，現(xiàn)用現(xiàn)配。不建議使用乙醇，乙醇固定液對組織的滲透力較弱，影響TUNEL標(biāo)記效率.2. 細胞膜和核膜的通透不充分，TdT酶未能到達核內(nèi)。細胞與冰凍切片，可用0.2% Triton X-100溶液通透5-30min，石蠟切片推薦使用蛋白酶K，37℃通透30 min；不同的細胞和組織所需要的通透時間略有不同，時間太長容易脫片，適當(dāng)調(diào)整。3. 延長標(biāo)記時間至2h，并適當(dāng)增加TdT酶及dUTP的用量。4. 確定實驗對象細胞有凋亡。準(zhǔn)備一份DNase I處理的陽性對照，驗證TdT酶反應(yīng)是否正確進行。◆如何對細胞核進行復(fù)染？可在TUNEL反應(yīng)結(jié)束后對細胞核進行染色。◆為什么熒光背景高？1. 支原體污染：可以使用支原體染色檢測試劑盒驗證。2. TdT 酶反應(yīng)時間過長，可以用試劑盒提供的TdT酶稀釋液將TdT酶稀釋2-5倍后再按照說明書操作，稀釋后的TdT酶僅供當(dāng)日使用。3. 處于高速分裂和增殖狀態(tài)中的細胞，有時也會出現(xiàn)細胞核中的DNA 斷裂。建議：在非高增殖期取樣檢測；4. 有些試劑或細胞存在自發(fā)熒光，選擇染料時要避開自發(fā)熒光的顏色。5. DAB 孵育時間過長，減少DAB 染色時間。6. Biotin-X-dUTP 的非特異性結(jié)合，在TdT 酶反應(yīng)之后，再用含0.1% Triton X-100 和1 mg/ml BSA 的PBS 洗三次。◆標(biāo)記率低？1. 乙醇、甲醇或甲醛（市面上購買的甲醛大多含有甲醇）固定的樣品標(biāo)記效率較低（因為在固定時染色質(zhì)未能與蛋白質(zhì)交聯(lián)，而在操作中丟失），采用推薦的固定液。2. 固定時間過長，導(dǎo)致交聯(lián)程度過高，減少固定時間。3. 貼壁細胞如果使用藥物誘導(dǎo)凋亡，會細胞皺縮，貼壁黏附力降低，導(dǎo)致凋亡細胞容易脫落。建議：在凋亡誘導(dǎo)結(jié)束后，可以對多孔板進行1000g離心5min，然后再吸出培養(yǎng)基并用PBS洗滌。如果沒有適合的離心機，請注意操作輕緩，防止發(fā)生凋亡的細胞在洗滌時被洗去。后續(xù)整個操作也需要輕緩。◆在蛋白酶K中消化組織樣品多久？大部分組織樣品需要充分消化15分鐘。最佳的培養(yǎng)時間根據(jù)組織類型和厚度而不同。腦組織比其他組織需要更長的蛋白酶處理時間。◆實驗的組織切片應(yīng)該多厚？老鼠腸、腎臟、肝臟、心臟和結(jié)腸厚度5–20 μm。